果梅自交不亲和基因的克隆及自交亲和品种的鉴定

【摘要】果梅(PrunusmumeSieb.etZucc)原产于中国,属于蔷薇科典型的配子体自交不亲和(Gametophyticself-incompatibility,GSI)树种,但在长期进化过程中也出现了自交亲和品种(Self-compatibility,SC).GSI至少由S位点的花柱S(S-RNase)基因和花粉S(SFB/SLF)基因决定。为了进一步丰富果梅的自交不亲和基因信息和研究清楚自交亲和突变机制,本研究以南京农业大学国家果梅种质资源圃的果梅为材料,克隆了新的自交不亲和基因,并对自交亲和品种进行了鉴定分析。这些将对果梅品种田间授粉树的合理配置和杂交育种的亲本选择提供合理的依据,并为深入探讨果梅自交不亲和作用的分子机制奠定基础。主要研究结果如下：1.应用AS-PCR技术对18个果梅品种的基因组DNA进行扩增。所用引物Pru-C2和PCE-R,是根据李属S-RNase基因序列的第二和第三个保守区分别进行设计的。PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后,8个果梅品种扩增到两条目的条带,5个品种扩增到一条目的条带。其中只有一条目的条带的和没有扩增出目的条带的品种,再用具有更好分辨率的6.O%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。最后,14个品种的DNA经过PCR扩增都能得到两条目的条带,剩余4个品种每个只能检测到一条目的条带。经过克隆和测序分析,获得13个已知的S-RNase基因(S1、S2、S7、S9、S12、S14、S15、S18、S20、S22、S24、S23和S26)和7个新S-RNase基因(S30、S31、S32、S33、S34、S35和S36),新基因GenBank登录号依次为JN232975、JN232976、JN232977、JN232978、JX065222、JX065223、JX065224。2.利用根据李属SFB基因保守序列设计的引物SFB-ClF和Pm-Vb对12个品种的基因组DNA进行SFB基因的扩增。用琼脂糖凝胶电泳进行检测,每个品种只得到一条1000bp左右的条带。克隆和测序结果表明：每个品种都有两个不同的SFB基因,12个新SFB基因得到鉴定,新基因和GenBank登录号如下：PmSFB2(JQ356589)、PmSFB12(JQ356586)、PmSFB14(JQ356596)、PmSFB18(JX065217)、PmSFB22(JQ356584)、PmSFB24(JQ356595)、PmSFB3、(JQ356588)、PmSFB34(JQ356597)、PmSFB40(JQ356585)、PmSFB41(JQ356593).PmSFB42(JQ356581)和PmSFB43(JQ356578).另外,对本文鉴定的果梅S-RNase基因和SFB基因进行了序列分析,并通过RT-PCR验证了其表达情况,结果表明：它们都具有典型的基因结构,分别在花柱和花粉中特异表达。3.通过田间自交授粉试验确定了原产于中国的‘四川白梅’和‘长农17’两个果梅品种属于自交亲和品种。进一步通过AS-PCR分析发现花粉SFB基因存在一段插入序列,造成了分子水平的基因突变。推测该基因的突变使‘四川白梅’和‘长农17’花粉SFB功能发生改变,从而导致自交亲和。4.本研究通过重复的田间自交授粉实验确定了果梅品种‘早红’属于自交亲和品种。而杂交授粉实验表明：果梅品种‘早红’的自交亲和变异是花粉S基因功能的突变导致的。‘早红’S基因的序列分析和RT-PCR表达分析发现：S基因氨基酸序列具有李属S基因典型的结构特点,没有任何基因突变；‘早红’和具有相同S基因型的自交不亲和品种‘细叶青’具有近乎相同的表达水平。另外,一种新型F-box基因得到鉴定,但是,其表达蛋白功能未知。这些结果表明：‘早红’的自交亲和变异是由于花粉S基因功能突变导致的；S位点以外的修饰因子,包括F-box基因,可能与花粉S基因功能的丧失有关。
【作者】王培培；
【导师】高志红；
【作者基本信息】南京农业大学，果树学，2013，硕士
【关键词】果梅；自交不亲和；自交亲和；S-RNase；SFB；PCR；

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